調査・研究

キダイの人工授精と育成の試み

2015年　第60回水族館技術者研究会

展示課　新田　誠，吉田直幸

キダイDentex tumifronsは，青森県以南の日本海・千葉県以南の太平洋・東シナ海の水深80～200ｍに生息し，全長35㎝に達するタイ科魚類である．生体入手が困難なため，初期生活史に関する知見は乏しく，育成では，岡ら（1956）による1日齢までの記録しかない．育成個体の展示を目的として人工授精を試みた結果，1腹分の受精卵が得られ，8日齢までの仔魚の形態を記録した． 2015年10月16日に，新潟県長岡市の寺泊沖から親魚を入手した．雄は全長275mm，体重470ｇ，雌は全長262mm，体重330ｇで，船上で搾出法による採卵と採精を行った．完熟卵と精子が同時に採取できなかったため，先に採取した精子を人工精漿中に保管し，完熟卵入手後に乾導法で受精させた．採卵数は約9,000粒で，受精率は約3％であった．卵は0.91±0.02㎜（n=10）の無色透明の真球形の分離浮性卵で，0.17㎜（n=10）の油球1個が認められた．水温22.7±0.7℃で，受精後36時間で孵化した．孵化仔魚は，全長2.00㎜（n=1）で油球は卵黄（長径0.83㎜）の後端に位置していた．筋節数は9＋17＝26で，黄色素胞が眼の後端，卵黄，尾部の第20～23筋節に見られた．2日齢（n=1）で眼の黒化，開口を確認，尾部の黄色素胞が消失し，卵黄の大部分が吸収された．6日齢（n=1）で卵黄と油球の吸収が確認された．育成水温は22.3±0.5℃で，12日齢まで生存した．受精卵は30Lパンライトで水温約22℃で管理し，孵化仔魚は500Lパンライトで約22℃で育成した．初期餌料には開口直後から栄養強化（SCP：クロレラ工業㈱）したS型ワムシ（約150μm）を15個体/mLで給餌し，飼育水には冷凍ナンノ（K-2：クロレラ工業㈱）を毎日15g添加した．開口直後の口径は130μm（n=1），1日後で185μm（n=1）であった．仔魚が卵黄吸収期以降も生存したため，S型ワムシは餌料として適合したと考えられた．

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飼育下におけるロクセンスズメダイの育成

2015年　第60回水族館技術者研究会

展示課　西村祐加里，澁谷こず恵，新田誠

ロクセンスズメダイAbudefduf sexfasciatusは，神奈川県三浦半島～琉球列島の水深1～20ｍに生息するスズメダイ科オヤビッチャ属の魚類である．2014年6月に水量40㎥,水温21.5℃の水槽で擬サンゴを産卵床とした自然産卵が観察されたため，育成を開始した．本報告は，2015年8月29日に採取した卵から仔稚魚の育成にともなう個体の形態変化を記録したものである．卵は，孵化直前に産卵床ごと取り外し，500Lパンライトに収容した．飼育水は循環させ, 起流ポンプ（Koralia 5200:Hydor）を用いて5秒間隔で水流を当てた.照明は30W蛍光灯を日中のみ点灯した．孵化後は，産卵床を取り出し，仔魚の育成を行った．飼育水は循環させ，冷凍ナンノ(K-2:クロレラ工業)を15g/日添加した.照明は24時間点灯し，稚魚期以降は夜間に消灯した. 水温は，仔魚の成長促進を目的に，卵管理時は約27℃，仔魚育成時は約28℃に設定した．15日齢で育成個体が2個体となったため，以降の記録は生体観察とした．孵化後0-12日齢まで栄養強化（SCP:クロレラ工業）したS型ワムシを給餌し,11日齢からは強化アルテミアを併用給餌した．卵は長径1.32±0.03mm,短径0.59±0.10mm(n=5)の繭型をした付着沈性卵で卵黄が赤色を呈していた.産卵から最初の孵化までは，121時間を要した．孵化仔魚は,全長2.89±0.03 mm(n=5)で，油球（0.26±0.03mm）が卵黄（0.44±0.01mm）の腹面前方に位置していた．黄色素胞が卵黄上部および眼の後端から第3筋節にかけて密に見られた.口の形成は認められたが開口はしていなかった．開口は12時間後に確認された. 16日齢で1個体が着底し,稚魚期への移行が推測された.着底直後の体色は全身黒色を呈し，模様は認められなかった.23日齢で黒色横帯が4本出現し，25日齢で5本となった.30日齢で尾鰭上下両葉に黒色帯が現われ，成魚と同様の体色を示した．

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アカテガニの飼育下繁殖について

2014年　関東・東北ブロック水族館飼育技術者研究会

展示課　原田　彩知子

アカテガニ Chiromantes haematocheir は十脚目ベンケイガニ科アカテガニ属に分類される陸生のカニで、岩手県以南、南西諸島、台湾、中国北部に分布する。本種のゾエア幼生から稚ガニにいたる飼育知見は少ない。飼育下繁殖による育成記録を報告する。 親個体は2011年10月24日に佐渡市沢根海岸で採集した。2014年7月17日にアクリル水槽 (W400 mm×D250 mm×H200 mm) に、オス1個体とメス2個体を収容し、展示した。室温25 ℃、餌はアカムシ、栄養強化した冷凍ブラインシュリンプ、エビカニ用配合飼料、肉食魚用配合飼料を週5回の頻度で与えた。同年7月5日に抱卵を確認し、7月22日に海水をはったポリプロピレン製飼育容器 (W385 mm×D208 mm×H290 mm) へ移動した。7月23日に放出されたゾエア幼生を発見し、太鼓型アクリル水槽 (φ333 mm×D100 mm) へ収容した。止水下で弱く通気を行った。毎日1/3換水を行い、強化シオミズツボワムシと冷凍ナンノを与えた。メガロパ期で海から河口へ遡上することから、17日目にメガロパ幼生を確認してから、徐々に淡水の分量を増やした。餌は上記に加えて栄養強化したアルテミアノープリウス幼生も与えた。また、24日目からメガロパ幼生10個体をガラス製容器 (φ290 mm×H150 mm) へ移動し、餌は栄養強化した冷凍コペポーダに変更した。稚ガニは27日目から確認され、3個体は脱皮を追跡するため、300 mLデリカップに1個体ずつ収容した。稚ガニには強化冷凍コペポーダ・ブラインシュリンプ、粉砕したプレコ用配合飼料を与えた。毎日ほぼ全換水を行い、淡水は4日ごとに100 mLずつ増量し、69日目の現在、海水・淡水比は1:4である。 放仔後0日齢幼生は頭胸甲長0.37 ± 0.05 mm (mean ± SD、n = 5)、脱皮は水温26.9 ~ 27.2 ℃下において約4日間隔で観察され、8日齢0.66 ± 0.04 mm (n = 5)、17日齢メガロパ幼生は甲幅1.00 ± 0.08 mm (n = 5)、甲長1.01 ± 0.12 mm (n = 5) であった。最初に確認した稚ガニは、26.2 ~ 27.2 ℃下において27日齢で甲幅1.04 mm、67日齢で 4.10 mmに成長した。

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アカムツの人工採卵と育成

2014年　第59回水族館技術者研究会

新田誠（新潟市水族館マリンピア日本海）
八木佑太（（独）水産総合研究センター日本海区水産研究所）
飯田直樹（富山県農林水産総合技術センター水産研究所）

新潟市水族館では，2010年からアカムツの生体展示を目的として人工授精による仔魚育成を実施してきた．2013年からは，展示のほか，資源管理への応用も含めた共同研究として3機関で育成技術開発に取り組み，稚魚期までの育成に成功した．
親魚は，2013年9月中旬に新潟県の寺泊沖で採取した．船上で人工採卵を行い，乾導法で受精した．受精卵は，30Ｌパンライトで水温20.7±0.4℃，通気2.5Ｌ/分で管理した．仔魚は，500Ｌパンライト2槽で，水温22.4±0.9，22.6±0.6℃で飼育した．餌は，3～24日齢までS型ワムシ，以降はアルテミアを併用し，共に栄養強化（SCP：クロレラ工業㈱）して使用した．飼育水には，冷凍ナンノ（K-2：クロレラ工業㈱）を15ｇ入れた．照明は，蛍光灯（40W）で24時間点灯した．
1回の採卵量は，4.5万～16万粒（n=5）で，受精率は50～75％であった．卵は，0.82±0.01㎜（n=10）の球形の分離浮性卵で，約40時間でふ化した．ふ化率は，11.3～34.5％であった．仔魚は，ふ化直後で全長1.82±0.08㎜(n=4)，3日齢（2.87±0.08㎜，n=5）で開口した．16日齢（3.96±0.19㎜，n=4）で各鰭の原基が形成され，30日齢（7.46㎜，n=1）で前期稚魚期となった．稚魚は223尾で生残率は0.3％であった．1歳齢の生残は178尾で，稚魚期から若魚期までの生残率は79.8％であった．1歳齢の全長は120.5㎜（n=1）で，新潟の天然海域での全長82～98㎜（大西2009）を上回った．卵は，ふ化直前に沈下して死亡するため，常に浮遊させる通気量がふ化率の向上に有効であった．仔魚の育成水温は，過去の育成記録，天然海域での仔魚の鉛直分布，産卵期の水温の鉛直測定結果から22℃以上が適していると考えられた．仔魚は，7日齢以降から浮上死する個体が増加するため，常に1L／分の強めの通気で育成すると効果的であった．

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リニューアルに伴う新規展示水槽の工夫とLED照明の活用について

平成25年7月のリニューアルオープンに伴い，上部開放型水槽を用いたウェルカム水槽の導入と館全体に水槽照明のLED化を実施した．

ウェルカム水槽は，各地の海岸風景を再現した水槽を7基設置した．水槽の架台高を70㎝に統一し，幼児でもガラス越しに容易に観察できるようにした．架台高を低くしたことで，幼児用の踏み台が必要なくなるなどの利点があった．水槽4基は，ガラス高を60㎝とすることで水槽内部を上方からも観察できる効果を持たせ，干潟をテーマにした水槽では，巣穴が観察できるなどの展示効果が得られた．配管や配線などは擬岩や砂の中へ隠し，来館者によるいたずら防止と視覚効果の向上を意識した．

館全体の水槽照明には，LED照明を積極的に導入した．大水槽や浅瀬，熱帯の海をテーマにした水槽では，高輝度のLED（器具消費電力94Wおよび190WでHID215Wおよび415W相当），深海を再現した水槽ではスポットLED（器具消費電力14WでHID65W相当）を採用した．LED照明の利点として，省エネ効果によるコスト削減，放熱により生じる水温上昇の軽減，波紋効果などが得られた．欠点として，多重影，深度による飼育水の黄ばみ，波紋よる深海演出効果の低下，他色との混ざりにくさなどがあった．これらは，LED照明の多灯，色セロファンや乳白板フィルターの使用，HID併用等の工夫により改善できた．

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カマイルカの連続射精における精液性状の変化について

展示課　加藤結

カマイルカLagenorhynchus obliquidensの連続射精時の精液量, 精子濃度, 精子活性の変化を調査した.
供試個体は1頭の雄のカマイルカ（国内登録番号285, 2001年1月29日野生捕獲, 推定年齢 16歳, 体長 220cm ）. 2014年6月20日から2014年8月14日まで, 2日から5日おきに1日あたり連続3回を１セッションとし, 計19セッション採取を試みた. 精液採取は, 横臥姿勢での上陸後に, 生殖溝への接触刺激での陰茎露出, それに後続する射精を条件付けて, 20-30秒おきに実施した. 連続採取の時間間隔は, 当該間隔で精液を採取できていた過去の経験に基づいて決定した. 採取した精液は検査まで37℃の湯で保温した. 精子濃度は血球計算盤で算定した. 精子活性は, 牛の精液評価法に準じ, 精液をスライドガラスに貼ったパッチ状シール内に滴下し, 生存率と運動力（運動激烈から運動しないまでの5段階）を記録し, 運動力により重み付けした数値と生存率を掛け合わせて100で割り, 精子生存指数として評価した.
19回のセッション中, 3回とも射精があったのは11セッションであった. 精液量の中央値は1, 2, 3回目, それぞれ, 8.5ml, 1.0ml, 1.0ml. 精子濃度は6.0×10⁸/ml, 0.02×10⁸/ml, 0.004×10⁸/ml. 精子生存指数の平均値は47.3±32.4（標準偏差）, 43.3±23.2, 27.8±20.7であった. 精液性状は1回目が良く, 回を重ねるにつれ, 悪化する傾向にあった.
バンドウイルカでは15－20分間内に連続して9－10回射精が可能で, 1回目では量が多いが精子濃度は低く, 逆に2回目以降では, 量は少なくなるが, 精子濃度はピークに達することが報告されている. 今回の結果と差が生じた理由として, 射精間隔の違いが考えられる.

発表資料：2014年第40回海獣技術者研究会・カマイルカの連続射精における精液性状の変化について(1.29MB)

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シナイモツゴの系統保存について

2013年 東京大学大気海洋研究所共同利用研究集会　水族館との共同研究。その現状と、将来展望に期待を込めて

展示課　石川訓子
新潟大学理学部　坂井雅人，酒泉 満

シナイモツゴは、かつて関東から東北地方に広く分布していた種であるが、現在では東北６県および新潟県と長野県でのみ確認されている希少淡水魚（絶滅危惧ⅠA：環境省）である。1995年よりJAZAの種保存事業繁殖対象種に選定され、現在6園館にて保存活動を行っている。新潟市水族館では選定時より種別計画管理者を引き受け、本種の保存に努めてきた。

近年多くの種において遺伝的系統が調査され、系統を重視した保存活動が展開されるようになっている。しかし本種においては、一部の地域間での調査報告があるのみで、生息地全体にわたる系統は調べられていなかった。そこで新潟大学に協力を得て、本種の保全に資するために遺伝的系統解析を行った。新潟大学の協力を依頼した理由は、1.メダカの遺伝的系統分析の実績があり専門知識と設備がそろっている　2.水族館から近い　3.以前より展示や研究での交流があった　の３点である。

まず本研究を行うにあたり当館保存個体を使用し予備実験を行った。予備実験では、調査領域（シトクロームB、16sリボソームRNA）の決定とプライマーの設計、実験方法やサンプリング方法等を試行した。実際にいくつかの系統があることが予想される結果が得られたため、それを踏まえ方針を決定した。同時にJAZAの野生動物保護募金による助成事業に申請、採択され研究費を得た。これにより一年間で研究を完了し活動の報告と公表の義務が生じた。
実際の役割分担は、検体の入手は水族館、実験方法の決定と設備提供・薬品の調合および実験機材の設定は大学、実験と塩基配列の決定は両者、分子系統解析は大学が担当した。なお打ち合わせはすべて大学で行った。助成研究費は、検体保存用のサンプル瓶とエタノール、大学で使用する試薬類に利用した。その他の支出として、検体輸送料やサンプリングにかかる費用は水族館、チップやチューブ等の消耗品や使用量が少ない薬品類は大学側が負担した。
水族館が受ける共同研究のメリットは、研究のデザインについての助言や実験の分担、設備の利用、解析作業など多大で、専門性の高い遺伝的系統解析が行えることであった。一方で、実働の共同研究者が大学院生であったため、課程修了により研究室から離れてしまい、その後の連絡が難しくなった。また、今後追加調査の必要が生じた際の引き継ぎ等が問題となると考えられる。大学側のメリットは、学生が社会と研究の接点を実感しやすい、研究成果の公開と社会への還元の良い機会となることなどがあげられる。また、１年間という期限のため、実験を進める中で必要となった追加実験の時間をつくることが困難であるという問題にも遭遇した。

本研究の結果、シナイモツゴは太平洋側(A)と日本海側(B)の2系統から成り、さらにBは5つの亜系統(B1~B5)に分けられることが判明した。現在保存している個体群は太平洋側の系統(A)と日本海側の２系統(B3,B5)に含まれ偏りがあった。今後は保存産地を見直すとともに新規の保存園館を募り、系統を重視した保存活動が展開できるよう努めたい。

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シナイモツゴの遺伝的系統解析

2013年 第58回水族館技術者研究会

展示課　石川訓子
新潟大学自然科学系　坂井雅人，酒泉 満

シナイモツゴ Pseudorasbora pumila pumila は，東北６県および新潟県，長野県で生息が確認されている希少淡水魚（絶滅危惧IA：環境省）であり，JAZAの種保存事業対象種として，現在6園館にて保存活動が行われている．しかし，種内の遺伝的多様性に関する網羅的な報告はない．今後の保存活動に遺伝的多様性の把握は必須であると考え本解析を行った．

検体は，各保存園館からの提供，各地の保護団体や動物園・大学からの提供，当館による野生個体の採集により，青森2，岩手6，宮城1，秋田2，山形1，福島2，新潟11，長野1の計26地点177個体を得た．またウシモツゴ1産地８個体を入手し外群に用いた．

尾鰭の二叉より先端部分の上下をハサミで切除後，96％エタノールにて固定したものを検体とした．各個体からフェノールクロロフォルム法によりDNAを抽出し，ミトコンドリアDNA上にあるシトクロームB（以下Cytb）と16SリボソームRNA（以下16SrRNA）をPCR法により増幅し，ダイレクトシークエンス法にてそれぞれの領域の塩基配列を決定した．その後，最大節約法とベイズ法にて分子系統解析を行った．その結果，Cytb では 13，16SrRNA では 14，Cytb＋16SrRNA では 16 のハプロタイプが検出された．最大節約法およびベイス法による分子系統解析の結果，これらは A，B，2つのクレードに大別できた．A は太平洋側のみに分布し，B は日本海側に分布していた．さらに Bは5つのサブクレード（B1~B5）から成っていた．

日本海側，特に新潟県内では異なる遺伝的系統が側所的または同所的に分布していることが判明した．また，現在の保存産地は3系統（A，B3，B5）のみであり，偏りがあることが明らかとなった．今後は遺伝的系統を踏まえた保存活動が展開できるよう図って行きたい．

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アカムツ人工授精卵のふ化条件と仔魚の育成温度について

2013年 関東・東北ブロック水族館飼育技術者研究会

展示課　新田 誠

親魚は，性成熟期間に該当する2012年10月2日と10月9日の2回採集した．船上で乾導法による人工授精を実施し，浮上卵を表層水温（約25℃）で酸素パック輸送した．以前（2010年，2011年）は，卵管理を採集海域の表層水温（受精水温約23℃）で実施したところ，沈降後に大多数の卵が死亡した．受精後の浮遊卵は継時的な沈降後にふ化するため，卵発生時の適正水温はより低温であると推測した．今回は約25℃の海水を満たした30?パンライト容器に受精卵を移した後，濾過槽に設置したクーラーで徐々に水温を低下させ，沈降後の水温を親魚の産卵水深（約100ｍ）を参考に水温約18℃で卵管理を試みた．また，過去2回では，沈降卵の放置がふ化率の低下を招いたため，エアーレーションによる強い通気を行い，常に卵が浮遊している状態を保つことで卵の沈降死を回避させた．結果，受精卵の大多数をふ化させることができた．ふ化までの時間は約35時間で，水温23℃の25時間より長くなった．ふ化仔魚は，500?パンライト容器でふ化時の水温約19℃で育成した．餌料には，栄養強化（SCP：クロレラ工業㈱）したS型ワムシを使用した．開口は，以前の育成時と変わらずふ化4日後であった．開口後，飼育水中に残ったワムシのさらなる栄養強化，光刺激の軽減などを考慮して，冷蔵ナンノ（ヤンマリンK-1：クロレラ工業㈱）50m?を飼育水中に毎日添加した．9日齢までは順調な成長が観察され，ワムシの摂餌も確認したが，その後成長が見られず，13日齢に大量死が見られた．19日齢まで育成した個体も成長が見られず，20日齢で最後の1尾が死亡した．受精卵の沈降死の対処方法は，卵管理時の強い通気と低水温管理が適していると判断されたが，仔魚の飼育に関しては，低水温飼育が成長阻害に起因した可能性を示唆し，水温の異なる環境での再試験が必要であると考えられた．

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左後肢基部が腫脹したゴマフアザラシ

2013年 第39回海獣技術者研究会

展示課　田村広野，岩尾 一，井村洋之

2013年6月6日午後（第1病日），1頭のゴマフアザラシ Phoca largha （雌,3歳）左後肢基部が直径約 6cm の半球状に腫脹した．元気ではあったが，午前より摂餌が無く，左後肢関節の強直，他個体や人への神経質感が顕著だった．同日夕方の患部の触診では熱感，硬結感，液体や固形物の貯留は感じられず，視診では明らかな出血や外傷は確認できなかった．対症療法として，抗生剤（アンピシリン 20mg/Kg,皮下注,1日1回）と鎮痛剤（ケトプロフェン 1mg/Kg,皮下注,1日1回）を投薬した．第1病日の血液検査では，白血球数と CK 値の高値，鉄の低値が顕著で，筋組織の異常をともなった炎症性疾患を示す所見であった．第2病日のエコー検査および穿刺生検でも有意な所見はなかった．第2病日には腫脹がやや縮小したが，摂餌はないため，皮下注射での投薬を継続した．

第3病日には摂餌が回復したため，経口での抗生剤（アモキシシリン 10mg/Kg,1日2回）と鎮痛剤（カルプロフェン 1mg/Kg,1日1回）の投与に切り替えた．第3病日の血液検査は，第 1 病日よりも改善傾向の所見であった．腫脹部は，第4病日以降から縮小しだし，第6病日にはほぼ正常に戻った．左後肢の動きは，第2病日以降からゆっくりと改善され，第6病日に左右差はほぼ無くなった．

鎮痛剤は第6病日，抗生剤は第10病日まで投与した．各種検査所見，抗生剤の反応からは，鼠径ヘルニア，壊死性筋膜炎，皮下膿瘍，血腫などの鑑別診断は除外され，蜂窩織炎に近い病態であったと考えられた．起因菌の特定はできなかったが，使用したグラム陽性菌用の抗生剤に反応したことから，人や他種動物の蜂窩織炎の原因菌として多い連鎖球菌やブドウ球菌の関与が考えられた．もし発症当日に血液培養を行っていれば，起因菌を分離できたかもしれない．

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